Exkursion 2013

Am Freitag, dem 01.02.2013, besuchten die beiden Biologie – LKs der CWS von Herrn Bertelsbeck und Frau Dr. Waldner-Müller das Schülerlabor in der Herderschule, um die eigene aus Mundschleimhautzellen gewonnene DNA mithilfe eines genetischen Fingerabdrucks zu untersuchen.

Der genetische Fingerabdruck wird aus der DNA eines Menschen angefertigt und dient unter anderem in der Kriminalistik zur Ermittlung von Tätern einer Straftat, wird aber auch bei Vaterschaftstests eingesetzt. Durch den genetischen Fingerabdruck ist es allerdings nicht möglich, Aussagen über Persönlichkeitsmerkmale zu treffen, z.B. über die Haarfarbe oder die Augenfarbe. Da nur 3% unserer gesamten DNA für den Bauplan unseres Körpers zuständig sind, besteht der Rest aus sogenannten nichtcodierenden Bereichen. Aus diesen Bereichen wird die DNA für den genetischen Fingerabdruck gewonnen. In diesen nichtcodierenden Anteilen der DNA gibt es Basenabfolgen, die bei jedem Menschen unterschiedlich oft wiederholt werden, sodass jedem Menschen eine Sequenz mit einer bestimmten Anzahl von Wiederholungen zugeordnet werden kann.

Um den genetischen Fingerabdruck herstellen zu können, untersuchten wir im Labor den D1S80 Locus, einen Mikrosatelliten auf dem ersten Chromosom.

Die Herstellung des genetischen Fingerabdrucks erfordert drei Hauptarbeitsschritte. Zuerst wird die DNA aus der Mundschleimhaut isoliert, danach wird der DNA-Abschnitt D1S80 mithilfe von PCR (eng. Polymerase Chain reaction) vervielfältigt. Abschließend erfolgt die Bandentrennung mithilfe der Agarosegelelektrophorese unter Zusatz von Ethidiumbromidlösung, die eine Auswertung unter UV-Licht ermöglicht.

Damit uns bewusst wurde, mit welchen kleinen Mengen wir arbeiten werden, durften wir zunächst mithilfe der Eppendorf-Pipetten verschiedene Wassermengen pipettieren, die ca. 400x kleiner als ein Regentropfen waren.

Anschließend begannen wir mit der DNA – Isolierung aus unseren Mundschleimhautzellen.

Dafür spülten wir ca. 2 Minuten lang unseren Mund mit 8 ml Wasser aus. In diesem Wasser befanden sich nun Zellen aus der Mundschleimhaut und somit auch unsere DNA. Anschließend zentrifugierten wir die Lösung mehrmals, sodass die DNA als Zellpellet im Eppendorfgefäß (Eppi) vorlag und wir Lysepuffer, welcher die Zellen aufbricht, hinzugeben konnten. Durch das Auflösen der Zellen bzw. vielmehr der Zellmembranen konnten wir nun die störenden Proteine mit Fällungspuffer ausfällen und durch Zentrifugieren von der DNA trennen. Nun gaben wir zu dem übrig geblieben Material Isopropanol. Die DNA ist in Alkohol unlöslich und fällt deswegen als Pellet aus. Wir schnipsten den Überstand aus dem Eppi heraus und stellten unser Eppi mit dem Pellet in einen Hitzeblock mit 60°C, um unser DNA - Pellet zu trocknen. Anschließend wurde die DNA in 0,03 ml Wasser aufgenommen.

Jetzt folgte der 2. Teil des Versuchs, die Vervielfältigung der DNA mittels PCR(= polymerase-chain-reaction). Dafür benötigten wir einen PCR-Mix, der aus UV-Wasser, PCR-Puffer mit MgCl₂ und dNTP-Mix, D1S80 Primer-Mix (spezifische Primer, die nur die Basenabfolge neben den Mikrosatelliten erkennen), DNA-Polymerase und unserer DNA-Lösung bestand. Den PCR-Mix haben wir selbst hergestellt und hierbei war die genaue Beachtung der Reihenfolge bei der Zugabe der einzelnen Stoffe von großer Bedeutung.

Die Vervielfältigung wurde mithilfe der PCR-Maschine erstellt, in der in 35 Zyklen bis zu 4,3 Milliarden Vervielfältigungen entstehen können. Ein Zyklus dauerte ca. 6 min 15 sec und bestand aus den Schritten Denaturierung (Auftrennung der DNA-Einzelstränge), Annealing  (Anlagerung der Primer und Aktivierung der Polymerasen) und Elongation (Vervielfältigung des gewünschten DNA – Abschnittes).

In der Wartezeit wurde das Agarosegel für die Gelelektrophorese angesetzt. Dazu wurden Agarose und TAE-Puffer zusammen erhitzt und nach leichtem Abkühlen Ethidiumbromidlösung dazugegeben. Nun konnte das flüssige Gel in die Elektrophoreseapparatur gegeben werden. Bevor das Gel erstarrte, wurde ein Kamm in das Gel gesteckt, sodass Taschen für unsere Proben entstanden. Anschließend übergossen wir das erhärtete Gel mit TAE-Puffer und füllten unsere DNA-Proben, welche wir vorher noch mit Glycerin zur Erhöhung des spezifischen Gewichtes und blauem Farbstoff gemixt hatten, in die Geltaschen und legten eine elektrische Spannung an. Nach Beendigung der Elektrophorese stellten wir das Gel unter UV-Licht, um die DNA – Banden zu erkennen. Die negativ geladenen DNA-Stücke waren in Abhängigkeit von ihrer Länge im elektrischen Feld unterschiedlich weit gewandert.

Je nach Bandenmuster konnte man nun feststellen, ob man in Bezug auf den Mikrosatelliten homozygot oder heterozygot war.

Jeder von uns konnte einen gelungenen genetischen Fingerabdruck als Erinnerung (Foto) mit nach Hause nehmen.

Der Tag war also sehr informationsreich und hat uns allen sehr geholfen, den theoretischen Unterrichtsstoff besser zu verstehen, da man selber Hand anlegen konnte und die einzelnen Schritte mit Unterstützung durch ein Script und zweier kompetenter Betreuerinnen des Labors ganz genau nachvollziehen konnte. Außerdem war es sehr interessant etwas über Laborarbeit zu erfahren und einige Geräte kennen zu lernen, von denen man sonst nur in Schulbüchern liest oder Bilder sieht.

Beitrag von: Isabel Prüfer, Inga Rupp, Klara Sauer, Nina Wahl